더 나은 효소의 진화를 안내하는 데 사용되는 NMR 분광기 | 검색

단백질 엔지니어는 새로운 효소를 생성할 뿐만 아니라 단백질의 특성을 개선하기 위한 도구로 유도 진화를 사용합니다. 자연 선택을 모방함으로써 일반적으로 원하는 기능을 가질 수 있는 변이체 라이브러리를 생성하기 위한 유전자 돌연변이 주기가 포함됩니다. 그러나 특정 단백질에 대한 잠재적인 돌연변이가 너무 많기 때문에 탐색의 여지가 넓습니다.

고급 계산 방법은 일반적으로 과학자들이 유익한 돌연변이 부위를 예측하여 돌연변이를 도입할 위치를 선택하는 데 도움이 됩니다. 그러나 이 구조 정보는 사전에 필요하며 항상 관심 단백질에 대해 알려진 것은 아닙니다. 더욱이, 이러한 방법은 효소의 활성 부위에서 멀리 떨어진 돌연변이를 예측하는 데 어려움을 겪으며, 이는 활성을 상당히 향상시킬 수 있습니다.

지시적 진화는 매우 강력하지만 숫자 게임에 의해 실제로 제한됩니다. 무차별 대입으로 탐색할 가능성이 많이 있습니다. 이반 코린도비치 미국 Syracuse University에서 그녀의 연구실은 일본과 벨기에의 동료들과 함께 새로운 연구를 수행했습니다. “실제로 찾을 수 있는 클론다이크로만 검색을 제한하기보다는 전 세계에서 무작위로 금 매장지를 검색하는 것으로 생각하십시오.”

유용한 돌연변이 유발 핫스팟을 식별하는 다른 방법을 찾기 위해 Korindowicz와 그의 팀은 복잡한 계산이 필요한지 궁금했습니다. 대신, 그들은 NMR 분광법이 사전 구조적 정보 없이 핫스팟을 밝히고 원하는 기능적 효소에 도달하기 위한 일련의 단계에서 유도 진화를 안내하는 경로를 제공할 수 있다는 직관에 따라 행동했습니다.

긴 게임

그들의 직감을 증명하기 위해 데이터를 수집하고 처리하고 진화 실험을 안내하는 데 8년이 걸렸습니다. Korendovic은 가장 큰 도전 중 하나는 사람들에게 자신이 진짜라는 것을 확신시키는 것이라고 말합니다. “우리는 잠시 동안 효소를 설계해 왔지만 이것은 정말로 물 속의 모든 것을 날려버렸습니다.”라고 그는 말합니다. 처음에는 우리가 얼마나 성공적이었는지 믿을 수 없었습니다. 우리는 어리석은 실수를 하지 않도록 여러 사람에게 실험을 반복하게 했습니다.

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이 기술은 효소가 억제제에 결합할 때 효소의 변화를 측정하여 핫스팟을 식별합니다. 이러한 변화는 NMR 스펙트럼에 반영되며 더 많이 변경된 신호는 유익한 돌연변이가 발생할 수 있는 단백질 영역을 나타냅니다.

팀은 비효소적 철 단백질인 미오글로빈에서 단백질 디자인을 테스트하기 위한 일반적인 반응을 촉매하는 Kemp Eliminase라는 새로운 효소를 개발하여 접근 방식을 시연했습니다. 미오글로빈이 아미노산 히스티딘의 치환에 따라 산소 결합과 관련된 촉매 기능을 채택한다는 것은 이미 알려져 있다. 이 돌연변이 형태의 미오글로빈으로 시작하여 팀은 NMR을 사용하여 Kemp의 제거를 촉진하는 방향으로 개발했습니다. 그 결과 제거에는 3개의 돌연변이만 필요했으며 그 효율성은 컴퓨터 유도 진화 및 생물정보학 접근 방식으로 설계된 단백질의 효율성을 능가했습니다.

“접근 방식은 간단하지만 우아합니다.” 애드리언 번젤 그는 취리히에 있는 스위스 연방 공과 대학에서 유도 진화를 통해 효소를 제조하고 있습니다. 구조 생물학자들은 결합이 시간이 지남에 따라 단백질에 어떻게 영향을 미쳤는지 분석했습니다. 여기서 흥미로운 점은 저자가 접근 방식을 뒤집고 다음과 같은 질문을 시도하는 천재적인 아이디어를 가지고 있다는 것입니다. 단백질의 변화가 결합에 어떤 영향을 미칩니까?

Bunzel은 이 접근 방식의 가능성에 대해 흥분하지만 NMR 스펙트럼이 먼저 할당되어야 한다는 약간의 단점을 지적합니다. “단백질의 크기와 유연성에 따라 단백질을 얻는 데 오랜 시간이 걸릴 수 있습니다.”라고 Banzel은 설명합니다. “그러나 일단 작업이 완료되면 NMR 유도 진화는 효소 공학을 향상시키고 고도로 활성인 생체 촉매를 생성할 것을 약속합니다.”

Korindovich는 “우리의 접근 방식이 업계에서 사용되는 반응을 포함하여 다양한 반응에 대해 현장에서 널리 사용되기를 정말로 희망합니다.”라고 말합니다. 궁극적으로 우리는 이것이 게임 체인저가 될 것이며 요구에 따라 효소를 개발할 수 있도록 하는 지시 진화의 힘을 발휘할 것이라고 믿습니다.

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